大豆PCR檢測試劑盒檢測反應(yīng)步驟與注意事項詳述
瀏覽次數(shù)：995發(fā)布日期：2019-05-24
大豆是常見的農(nóng)作物，很多時候需要通過檢測大豆專一性內(nèi)源基因的存在來判斷某些食品中是否含有大豆成分或添加劑。大豆PCR檢測試劑盒即是基于基因熒光探針PCR法的大豆Lectin基因的快速檢測試劑盒，適用于樣品中大豆源性成分的快速檢測。
大豆PCR檢測試劑盒產(chǎn)品特點
1.靈敏度高，分析靈敏度可以達(dá)到50拷貝/uL，遠(yuǎn)高于常規(guī)方法，也比常規(guī)的PCR檢測高100倍。
2.特異性高，根據(jù)大豆Lectin基因的保守區(qū)設(shè)計引物，不會誤檢。
3.一管封閉式，避免了PCR產(chǎn)物對后續(xù)PCR的污染。
4.線性范圍廣，在10-107拷貝/uL的靶分子濃度范圍內(nèi)均呈線性。
5.簡單快捷，只需要2小時即可得到實驗結(jié)果。
類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；
3、大豆RR/SS PCR檢測試劑盒引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的"半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
大豆PCR檢測試劑盒操作注意事項：
1：組份A中含有染料，染料的加入不影響PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可直接電泳，節(jié)省時間。
2：本試劑盒檢測范圍涵蓋支原體所有種屬，真核細(xì)胞和革蘭氏陰性菌不會造成干擾，與支原體親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌在反應(yīng)中的靈敏度較支原體低1000-10000倍。
3：本試劑盒適用于檢測支原體感染，客戶如需區(qū)分感染的種屬，可將PCR產(chǎn)物切膠然后測序，進(jìn)行序列比對即可知種屬類型。
4：有時可直接用細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。培養(yǎng)上清中常含有高濃度的PCR抑制劑，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，故不建議使用此法。有些PCR抑制劑用離心可以除去，若離心不能去除，則推薦抽提基因組DNA進(jìn)行PCR。而某些PCR抑制劑，如黑色素，通過抽提基因組DNA也不能去除，此時可以通過加入高濃度（如2%）的BSA（牛血清白蛋白）中和其抑制活性。
5：假陰性結(jié)果判斷方法：在測試反應(yīng)管中同時加入測試樣品和陽性對照樣品，觀察對照條帶是否出現(xiàn)。在陽性對照管出現(xiàn)對照條帶的情況下，如果測試反應(yīng)管的對照條帶和檢測條帶都沒有出現(xiàn)，則可判斷為PCR反應(yīng)受到了抑制，即假陰性結(jié)果。陽性對照管如果沒有出現(xiàn)對照條帶，請檢查PCR條件是否恰當(dāng)，或者與我們聯(lián)系。
6：每個測試樣品建議做兩個反應(yīng)：一個與陽性對照樣品共同反應(yīng)，排除假陰性結(jié)果，另一個單獨反應(yīng)，可避免因加入陽性對照樣品所致的靈敏度降低。如果測試樣品中支原體含量很高，可能會抑制陽性對照條帶的出現(xiàn)。
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