支原體PCR檢測試劑盒怎么用？反應(yīng)要素有哪些？
瀏覽次數(shù)：827發(fā)布日期：2019-12-16
支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核生物，大小一般在0.3～0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀，分枝狀等多種態(tài)。它不同于細(xì)菌，也不同于病毒，種類繁多，分布廣泛，造成的危害相當(dāng)大，涉及人、動物、植物及昆蟲等多個領(lǐng)域。牛支原體（MycoplasmaBovis）是重要的致病性牛寄生支原體，呈流行趨勢，可引起牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、等多種疾病，發(fā)病率達(dá)到60%-100%，但病死率不高。牛支原體并不總是引起牛的疾病，在健康或患病的牛身上均可發(fā)現(xiàn)其存在。由于牛支原體的疾病表現(xiàn)和對治療和疫苗的反應(yīng)常發(fā)生變化，對它的診斷和控制較為困難。
對牛支原體的檢測，可以通過血清學(xué)方法（如免疫熒光法和免疫印跡法），或遺傳學(xué)方法（如基于RRS基因的PCR法或寡核苷酸互補(bǔ)配對），進(jìn)行檢測。后來的研究發(fā)現(xiàn)牛支原體的實(shí)驗(yàn)室菌株和野外分離獲得的菌株存在抗原和遺傳學(xué)上的變異，對上述檢測方法形成了干擾。
基于穩(wěn)定的管家基因的PCR可以排除上述變異的干擾。因此，牛支原體PCR檢測試劑盒選取了一個種內(nèi)變異很小的與DNA修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行PCR鑒定，引物經(jīng)BLAST驗(yàn)證為特異性靶向牛支原體，與其他生物的基因組不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。使用本試劑盒檢測了22種不同的?；蜓蚣纳灾гw，僅有牛支原體產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶。而對13個實(shí)驗(yàn)室或野外分離的牛支原體菌株，本試劑盒均可產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶。可見本試劑盒具有物種特異性，可用于牛支原體的鑒定和檢測。
本試劑盒利用兩對引物通過巢式PCR法特異性擴(kuò)增支原體基因組DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)對支原體的高靈敏度特異性檢測。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設(shè)計一對F1/R1引物，用于擴(kuò)增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的第一輪PCR(1stPCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23SrRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計一條F2引物，在編碼23SrRNA的DNA上設(shè)計一條R2引物進(jìn)行巢式PCR的第二輪PCR(2ndPCR)。
每個試劑盒都配有陽性對照，便于確定PCR檢測是否能正常工作，及樣品中是否存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。
利用PCR法檢測試劑盒不僅能夠檢出是否有支原體污染，還能根據(jù)條帶大小確定支原體種類，可謂是一舉兩得！
使用方法：
一、發(fā)酵支原體PCR檢測試劑盒樣品RNA的制備
1、用自選方法抽提病毒樣品RNA。注意：可以選用本公司的一管式病毒RNAout
2、或柱式病毒RNAout。
二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成cDNA
1.按下表配制RT反應(yīng)體系（20μL體系）
2.70℃保溫5分鐘變性模板后立即冰浴。
3.嚴(yán)格按順序加入6μLRTBuffer（含dNTP）和2μLMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（含RI），反應(yīng)終體積為20μL。
4.42℃保溫60分鐘。此步為RT反應(yīng)。
5.70℃保溫10分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作為PCR模板使用，丌需要純化。
注意事項：
①加入試劑的順序，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
?、谑褂酶蓛舻乃芰先萜髋渲孟礈煲?。
③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測試劑盒說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
?、艿孜顰應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
?、菹礈烀笜?biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
?、奘褂靡淮涡缘奈^以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
?、邔?shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
?、嘣噭?yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
支原體PCR檢測試劑盒反應(yīng)要素：
發(fā)酵支原體PCR檢測試劑盒參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
?、僖镩L度：15-30bp，常用為20bp左右。
?、谝飻U(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
?、菀?'端的堿基，特別是底部及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
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