ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)疑難解讀
瀏覽次數(shù)：1658發(fā)布日期：2024-07-01
標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法，在ELISA實(shí)驗(yàn)中比較常用的一種分析方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線做的好與壞會(huì)直接影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，甚至是關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。那么在ELISA實(shí)驗(yàn)中，這一方面該如何處理呢？
一、ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)解答內(nèi)容：
1.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度*陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
2.采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。
3.樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。
4.做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng)，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對于有些實(shí)驗(yàn)，至少要0.99甚至是0.999。
6.檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。
7.標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn)，但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度得到后，可通過計(jì)算器、Excell或SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行繪制，并得到相關(guān)的回歸方程(即計(jì)算公式)和相關(guān)系數(shù)(回歸系數(shù))。
二、選擇什么方程去擬合
用于免疫檢測的所謂“標(biāo)準(zhǔn)曲線"其實(shí)稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測時(shí)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(可以是倍比稀釋的，也可以不是)濃度如果和相應(yīng)的吸光度(OD)值如果能 夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是理想的了，這時(shí)可以通過EXELL等方便的獲得擬合曲線，進(jìn)而推算出樣品的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時(shí)候能夠有這么理想的情 況，標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系，這時(shí)就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。
關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的 適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的適用性。當(dāng)然，如果用于定量，還是在中間一段較 好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用，但也都可以用。關(guān)鍵在于你的標(biāo)準(zhǔn)曲線做到了S形的哪一部分，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃 度部分可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部分可以用直線方程，中間部分可用對數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。
目前國際上流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進(jìn)一步比較正確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。
其實(shí)，在一個(gè)長的區(qū)間內(nèi)，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。但并不是說它就是萬能的。事實(shí)上不僅是ELISA，其它很多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲 線，也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事，而用它來定量是另一回事。如果用來定量，S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的，而兩端的平 坦部分計(jì)算誤差會(huì)大，有時(shí)甚至?xí)艽蟆?br />
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