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測(cè)定意義

蔗糖是源（葉片等）光合產(chǎn)物向“庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是雙向反應(yīng)酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其分解方向SS-Ⅰ的活性對(duì)于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。

測(cè)定原理

SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量來(lái)反映酶活性的高低。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

試劑的組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存；

試劑二： 液體5mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×2支，-20℃保存；臨用前每支加入1.2mL試劑二充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用；

試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備： 

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測(cè)定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻，30℃準(zhǔn)確水浴30min后，95℃水浴10min

95℃水浴5min左右，冷卻至室溫

混勻，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm下測(cè)定各管

吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

SS-Ⅰ活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0012x - 0.0492；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為ΔA。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/g鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.05mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0006x - 0.0492；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為ΔA。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/g鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.05mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

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