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測定意義：                           

ACL（EC4.1.3.8）是脂肪酸合成中的關鍵酶，其催化產生的乙酰輔酶可用于脂肪酸合成和碳鏈延長、黃酮類物質合成、氨基酸合成等。

測定原理：

ACL在ATP和輔酶存在的情況下催化檸檬酸裂解為乙酰輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸鹽。蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，在340nm測定NADH減少速率，計算ACL活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體2μL×1支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定

（1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉移至試劑一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；（注意：可取少量試劑一至試劑二和試劑三中，充分混勻溶解后轉移至試劑一瓶中，重復2-3遍）；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

ACL活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）ACL活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細菌或細胞中ACL活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）ACL活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細菌或細胞中ACL活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

ACL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

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