DOP-PCR試劑盒重點(diǎn)操作步驟，一定要看
瀏覽次數(shù)：800發(fā)布日期：2020-03-18
DOP-PCR即Degenerated Oligonucleotide Primed PCR(簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(yīng))，它與普通PCR的區(qū)別在于其使用單一的半簡并引物和低復(fù)性溫度，半簡并引物由特定序列+簡并序列+特定序列三部分組成，因此沒有種屬特異性，也跟DNA的復(fù)雜性無關(guān)，能均勻地?cái)U(kuò)增真?zhèn)€基因組，尤其適用于痕量DNA樣品的擴(kuò)增。
產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品可用于不經(jīng)過E.coli 培養(yǎng)和質(zhì)粒提取而直接從轉(zhuǎn)化子中篩選重組子，其原理是直接利用E.coli 菌落作為PCR模板，以識別載體質(zhì)?；?和插入片段順序的寡核苷酸為引物對重組子進(jìn)行篩查，通過PCR產(chǎn)物的有無和片段的大小來判斷外源DNA片段是否被成功克隆到載體質(zhì)粒之中，使用本產(chǎn)品可以使質(zhì)粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時(shí)。
1. 簡單快速，用戶只需要提供PCR引物和E.coli 菌落，不需要培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，整個(gè)篩選過程從一天縮短到2-3小時(shí)，節(jié)約時(shí)間和成本。本產(chǎn)品與常用E.coli 菌株和載體兼容。既可小規(guī)模篩選，也適用于大規(guī)模篩查。
2. 高靈敏度，既可用于高拷貝質(zhì)粒，也適合于低拷貝質(zhì)粒。
3. 高特異性，本產(chǎn)品采用了十分有效的辦法控制了培養(yǎng)基上殘留質(zhì)粒對PCR的影響，使假陽性率低于5%，而絕大部分同類產(chǎn)品的十分容易出現(xiàn)假陽性。
4. PCR反應(yīng)體系中含有惰性電泳染料，反映完成后可直接上樣電泳，不需另加上樣液。
5. 處理過的菌落樣品低溫長期保存后仍能用于PCR篩查。
6. 性價(jià)比高，價(jià)格更質(zhì)粒提取試劑相當(dāng)，但節(jié)約一天時(shí)間。
DOP-PCR試劑盒操作步驟：
(一)獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn))，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、DOP-PCR試劑盒(DOP-PCR Kit)載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、 測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
(四)誘導(dǎo)表達(dá)
1、DOP-PCR試劑盒(DOP-PCR Kit)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
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