詳細分析大豆PCR檢測試劑盒中PCR反應五要素
瀏覽次數(shù)：761發(fā)布日期：2021-01-26
大豆PCR檢測試劑盒采用反應體系預先分裝20ul反應液的模式，用戶只需每孔加入5ul的DNA樣品即可上機測試，大大提高了使用的便捷， 同時減少了交叉污染的機率。使用者需要幾個PCR管就剪下幾個PCR管來室溫融化，避免整個試劑盒反復凍融，從而影響檢測效果。
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。
在聚合酶鏈式反應實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。
發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90°C以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應用，并逐步應用于臨床。
大豆PCR檢測試劑盒產(chǎn)品特點：
1、靈敏度高，分析靈敏度可以達到50拷貝/uL，遠高于常規(guī)方法，也比常規(guī)的PCR檢測高100倍；
2、特異性高，根據(jù)大豆Lectin基因的保守區(qū)設(shè)計引物，不會誤檢；
3、一管封閉式，避免了PCR產(chǎn)物對后續(xù)PCR的污染；
4、線性范圍廣，在10-107拷貝/uL的靶分子濃度范圍內(nèi)均呈線性；
5、簡單快捷，只需要2小時即可得到實驗結(jié)果。
PCR反應五要素：
參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設(shè)計引物應遵循以下原則：
1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
2、引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
5、引物3’端的堿基，特別是末及倒數(shù)幾個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
6、引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子很有好處。
7、引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
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