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免疫熒光技術(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。以熒光抗體方法較常用。 用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術。

免疫細胞熒光實驗流程：

1、細胞爬片制備

1）、將蓋玻片放入培養(yǎng)瓶或多孔板中

2）、細胞生長達到60％后取出蓋玻片

3）、用PBS清洗蓋玻片3次

4）、將蓋玻片（細胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福爾馬林中10至20分鐘（蓋

上蓋子以防止蒸發(fā)）

5）、用PBS清洗蓋玻片3次

6）、將蓋玻片放在濾紙上（細胞朝上）

7）、干燥8-10小時，放入-20°C保存

8）、實驗前解凍爬片，在室溫下用中性PBS浸泡10-15分鐘

注意：使用多聚甲醛和福爾馬林固定可能會導致綠色光譜中的自發(fā)熒光。在這種情況下，可以嘗試紅色或紅外的熒光素。

2、破膜

1）、0.1％Triton孵育10min

2）、PBS洗滌3次，每次3分鐘

3、抗原修復

1）、用濾紙擦干細胞爬片

2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修復液

3）、在室溫下孵育10分鐘

4）、用PBS洗滌3次，每次10分鐘

4、封閉

1）、在爬片上加入5％BSA封閉液（種屬與二抗來源相同）

2）、37°C孵育30分鐘

3）、甩掉多余的液體并用濾紙擦干（不需要洗滌）

5、一抗孵育

1）、用抗體稀釋液稀釋一抗，達到抗體制造商推薦的濃度

2）、將稀釋的抗體（推薦濃度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育過夜

3）、用PBS洗滌3次，每次15分鐘

6、二抗孵育

1）、用抗體稀釋液稀釋生物素化的二抗

2）、將稀釋的抗體加到爬片上，37°C孵育30分鐘

3)、用PBS洗滌3次，每次8分鐘

7、染色

1)、爬片上滴加稀釋好的SABC-FITC或SABC-Cy3試劑

2）、37°C孵育30分鐘（避光）

3）、用PBS洗滌2次

4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min

5）、用PBS洗滌3次

6）、用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

實驗流程圖如下：