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測(cè)定意義

土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關(guān)鍵酶之一，參與亞硝酸鹽至NO的還原反應(yīng)，它的活性反映了生物降解過(guò)程中氮素的轉(zhuǎn)化效率，為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。

測(cè)定原理

亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2—減少，即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品

天平、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。

試劑的組成和配制

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解。

試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。

樣品處理

新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干，過(guò)30~50目篩。

測(cè)定操作表

計(jì)算公式

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）。

酶活單位定義：每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個(gè)酶活力單位。

S-NiR（μmol /d /g土樣）=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷1.5562×V標(biāo)÷W÷T

= 0.617×[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷W

T：反應(yīng)時(shí)間，1h=1/24d；V標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.7781x+ 0.0088，R2 = 0.996；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）。

酶活單位定義：每g土樣每天還原1μmol NO2ˉ 的量為一個(gè)酶活力單位。

S-NiR（μmol /d /g土樣）=[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷0.7781×V標(biāo)÷W÷T

= 1.234×[A空白管-(A測(cè)定管-A對(duì)照管) -0.0088]÷W

T：反應(yīng)時(shí)間，1h=1/24d；V標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL； W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)

1. 配制好的工作液3天內(nèi)使用完。

2. 若吸光值超過(guò)1.5，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

5. A空白管-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）線性范圍為0.02-1.5。

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