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測(cè)定意義

植物葉綠體中果糖1,6-二磷酸醛縮酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。催化果糖1,6-二磷酸和景天庚酮糖1,7-二磷酸的合成反應(yīng)，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng)。

測(cè)定原理

果糖1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙酮生成NAD和α-磷酸甘油，340nm處吸光值的變化可反映果糖1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、震蕩儀、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制   

提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

①總FDA酶提?。?/strong>建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體FDA酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿FDA酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中FDA酶活性。

建議測(cè)定總FDA酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的FDA，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定操作

1. 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，20μL試劑四，20μL試劑五，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2，△A=A1-A2

計(jì)算公式

1. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

                = 321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

2. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

                = 643.08×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T= 643.08×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

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