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正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

花色苷是一類(lèi)易溶于極性溶劑的天然色素，屬黃酮類(lèi)化合物?；ㄉ諒V泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中，使其呈現(xiàn)由紅到紫等不同顏色，是植物主要的呈色物質(zhì)。

測(cè)定原理：

采用pH示差法測(cè)定花色苷含量，當(dāng)pH為1.0時(shí)花色苷在530nm處有最大吸收峰,而當(dāng)pH為4.5時(shí),花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色查爾酮形式,在530處無(wú)吸收峰, 利用此特性分別測(cè)定在不同pH下的530nm和700nm處的吸光度值。pH示差法減少了溶液pH和溶劑差異的影響，排除了其他非花色苷類(lèi)物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100 mL× 1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20 mL× 1瓶，4℃保存；

試劑二：液體20 mL × 1瓶，4℃保存；

花色苷的提?。?nbsp;

按照烘干樣品質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g烘干樣品，加入1mL提取液），充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中，提取液定容至1 mL，蓋緊后4℃浸提24 h，8000 g，常溫離心10 min，取上清液待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上；試劑一和試劑二25℃（室溫）預(yù)熱10min以上；

2、取20 µL上清液和180 µL試劑一（相當(dāng)于稀釋10倍），40℃水浴20min，分別測(cè)定530nm和700nm處的吸光值，分別記為A1和A2。

3. 取20 µL上清液和180 µL試劑二（相當(dāng)于稀釋10倍），40℃水浴20min，分別測(cè)定530nm和700nm處的吸光值，分別記為A3和A4。

4. 計(jì)算△A=(A1-A2)-(A3-A4)

注意：如果A1大于1，可以適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)，保證總體積200 µL不變，如10 µL上清液和190 µL試劑一（相當(dāng)于稀釋20倍）；如果A1小于0.1，可以適當(dāng)縮小稀釋倍數(shù)，保證總體積不變，如100 µL上清液和100 µL試劑一（相當(dāng)于稀釋2倍），使A1保持在0.1~1范圍內(nèi)，可提高檢測(cè)靈敏度；同樣調(diào)整上清液和試劑二體積比例；計(jì)算時(shí)以實(shí)際稀釋倍數(shù)代入下述公式中。

花色苷含量計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

花色苷含量（µg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=16.7×ΔA× F÷W

V：提取液體積，1×10-3L；ε：花色苷的摩爾消光系數(shù)，2.69×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；M：花色苷的相對(duì)分子質(zhì)量：449.2g/mol；F：稀釋倍數(shù)；106：1g=106µg；W：樣本干重：g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

花色苷含量（µg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=33.4×ΔA× F÷W

V：提取液體積，1×10-3L；ε：花色苷的摩爾消光系數(shù)，2.69×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；M：花色苷的相對(duì)分子質(zhì)量：449.2g/mol；F：稀釋倍數(shù)；106：1g=106µg；W：樣本干重：g。ΔA線性范圍為0.005-0.5。

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