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正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP+和NADPH含量測定可以計(jì)算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm下檢測吸光值，從而測定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH，從而檢測NADP+含量。

所需的儀器和用品

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存； 

試劑二：粉劑×1支，-20 ℃保存，用時(shí)加入3mL蒸餾水，混勻；溶解后4 ℃保存一周；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入3mL蒸餾水，混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1支，4 ℃保存，用時(shí)加入3mL蒸餾水，混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑五：液體3.6mL×1支，4 ℃保存；

試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。

NADP+和NADPH的提取

1 血清（漿）中NADP+和NADPH的提取

NADP+的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADPH的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2組織中NADP+和NADPH的提取：

NADP+的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADPH的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中NADP+和NADPH的提取：

NADP+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADPH的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A(chǔ)1和測定管吸光值A(chǔ)2，計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若NADP+測定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH測定中△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時(shí)間20min延長到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。5、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管，本試劑盒100管保證測48個(gè)NADP+或NADPH.
NADP+和NADPH含量的計(jì)算

（一）NADP+含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中y為△A，x為NADP+濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NADP+含量計(jì)算

NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADP+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W

 (3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADP+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）

（二）NADPH含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.6198x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中y為△A，x為NADPH濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NADPH含量計(jì)算

NADPH含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADPH含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

注意：檢測限為0.01nmol/mL或0.01nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot

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